及其栽培变种的干燥未成熟果实。临床上常用于胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停等证。先前的大量研究显示枳壳的主要生物活性成分为辛弗林，柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷。当前，我们从中药枳壳中提取得到一种新的有效成分-- 水合橙皮内酯( Meranzin hydrate)，并发现枳壳促肠动力与抗抑郁的效应成分主要与水合橙皮内酯相关，而非橙皮苷和柚皮苷等。目前，大鼠体内水合橙皮内酯的药动学方法鲜有报道，更没有研究比较单味枳壳和水合橙皮内酯化学单体的药代动力学差异。为进一步阐明水合橙皮内酯的药动学，有必要对枳壳吸收入体内水合橙皮内酯的药动学进行分析。本文以水合橙皮内酯为目标化合物，应用高效液相色谱法研究对大鼠一次灌胃单味枳壳和水合橙皮内酯化学单体后，水合橙皮内酯在大鼠体内的药代动力学变化，以进一步探讨中药枳壳的作用物质基础。
1 材料与方法
1. 1 试验药物枳壳购于四川大学华西医院药房( 批号为: No.080130) ，经四川大学华西药学院张浩教授鉴定，质量符合药典标准。水合橙皮内酯购自成都地奥集团( 批号: 090412 - 5，纯度≥98%) 。
取枳壳10 g 加入超纯水120 ml，在室温下浸泡30min，沸后煎煮30min 过滤，再加60 ml 超纯水按上法煎煮后过滤，合并两次滤液。65°C 减压旋蒸浓缩，冻干。4°C 保存冻干粉直至使用，使用前将枳壳冻干粉配成0. 4 g /ml 的浓度。在使用前，将水合橙皮内酯配成0. 354mg /ml 的浓度( 等同于枳壳冻干粉中橙皮内酯的浓度) 用于大鼠灌胃。
1. 2 动物Waster 大鼠( 250 ～ 270 g) ，雄性，二级动物，购于四川大学实验动物中心，实验前正常饲养两周。实验动物使用许可证: SYXK 川2008 - 119，实验过程中对动物的处置符合2006 年科学技术部发布的关于善待实验动物的指导性意见。
1. 3 试剂2，4
- 二羟基苯甲醛( 内标，分析纯，纯度≥99. 5%)购自中国药品生物制品检定所。乙腈为HPLC 级( TEDIA Company，Fairfield，USA) ，水为超纯水。
1. 4 仪器Waters 2695 分离单元，2996 型二极管阵列检测器，Empower 色谱工作站; 色谱柱为Dikma Diamonsil C18柱( 250 mm× 4. 6 mm，5 μm) ，保护柱为Dikma guard 柱( 8 mm × 4 mm，5μm) ; 恒温水浴锅( 国华电器有限公司) ; KQ - 50 型超声波清洗器( 昆山市超声波仪器厂) ; Anke TGL - 16B 高速离心机( 上海安亭科学仪器厂) ; XW - 80A 型旋涡混合器( 上海青浦沪仪器厂) 。
2 方法
2. 1 色谱条件流动相: 乙腈- 水( 78∶ 22) ; 柱温为25℃; 流速:1 ml /min; 检测波长: 320 nm; 进样量: 60 μl。
2. 2 对照品溶液及内标溶液的配制精密称取2. 6 mg 水合橙皮内酯置于50 ml 容量瓶中，用乙腈溶解稀释至刻度，得52 ng /μL对照品储备液，以此来配制系列浓度的对照品溶液。精密称取内标2，4- 二羟基苯甲醛0. 5mg 置于100ml 容量瓶中，用乙腈溶解稀释至刻度，摇匀，得5 ng /μl 内标溶液。以上溶液均置于冰箱中4℃保存备用。
2. 3 枳壳中水合橙皮内酯含量的测定将枳壳冻干粉用水配制成浓度为5 mg /ml 溶液，首先于3000 r /min 离心10 min，取上清夜3 μl 进样。根据标准曲线，计算出水合橙皮内酯在枳壳中的含量分别为0. 04725%。水合橙皮内酯( 8. 217min) 在枳壳提取液的冻干粉中的色谱如图1 - a 所示，光谱如图1 - b 所示。
2. 4 血浆预处理方法取血浆150 μl，加入乙腈50μl，再加入含5 ng /μl 的2，4- 二羟基苯甲醛的乙腈溶液200 μl。混匀1 min，于10000 r /min 在4℃下离心10 min，取上清夜用0. 45mm 的滤膜过滤，进样60 μl，以峰面积比值进行定量分析。
2. 5 标准曲线的绘制于150 μl 的空白血浆中加入不同浓度的对照品溶液50μl 和内标溶液200μl，配制成含水合橙皮内酯浓度为12. 5， 25， 50， 100， 200， 500 and 1000 ng /ml 的系列溶液，按“血浆预处理方法”处理，以峰面积比值进行定量分析。
2. 6 药动学实验将Wister 大鼠12 只( 250 ～ 270 g ) 随机分为枳壳和水合橙皮内酯单体组，每组6 只。空腹12h 后，根据大鼠体重按剂量灌胃给药，分别灌胃枳壳和水合橙皮内酯单体，灌胃剂量以枳壳15g /kg 折算( 折合水合橙皮内酯为7. 08mg /kg) 。灌胃后，分别于5，10，15，30，45，60，90，120，240 min 取尾静脉血0. 25ml，用肝素血液抗凝， 8000 r /min 离心10min 后，用微量加样器吸取150μl 血浆，置于1. 5ml 离心管中，置- 20°C 冰箱内保存待用。
2. 7 数据分析血药浓度测定结果应用DAS 药动学统计软件进行处理，拟合房室模型并计算药动学参数。两组间比较采用t 检验，P < 0. 05 为差异具有统计学意义，所得数据均以珋x ± s 表示。
3 实验结果
3. 1 色谱行为在上述色谱条件下，在320nm 的监测波长下，水合橙皮内酯与空白血浆中杂质峰及内标峰( 2，4 - 二羟基苯甲醛) 达到良好分离，内标和水合橙皮内酯的保留时间分别为14. 87 min和20. 36 min。
3. 2 线性关系及检测限将空白血清加对照品得一系列的对照品进行分析，记录峰面积比值Y 对浓度C( μg /ml) 进行线性回归，可知水合橙皮内酯在12. 5 ～ 1000 ng /ml 内线性关系良好。回归方程( n = 5) 为Y = 0. 00166X + 0. 00338，r 2 = 0. 9997。以信噪比( S∶ N ﹥ 3) 计算最低检测浓度为10 ng /ml。
3. 3 精密度试验取内标液200μl 置于尖底离心试管中，加入不同量的水合橙皮内酯标准品储备液，再加入大鼠空白血浆150μl，共6 份，使血浆中水合橙皮内酯的浓度分别为50，200，1000ng /ml，按照“2. 4”项下操作，于1 日内重复测定6 次及连续7 日内测定7 次，计算日内及日间精密度。
A - 空白血浆; B - 空白血浆加标准品;
C - 大鼠灌胃水合橙皮内酯( 7. 08mg /kg) 30min 后的血浆样品;
D - 大鼠灌胃枳壳( 15g /kg) 30min 后的血浆样品
3. 4 回收率实验于200 μl 的空白血浆中加入低、中、高三个浓度的对照品溶液50 μl 和内标溶液150 μl，每个浓度平行为3 份。按本文的血浆预处理方法进行处理后，进样，测定峰面积比值。
3. 5 稳定性实验于200 μl 的空白血浆中加入低、中、高三个浓度的对照品溶液50 μl 和内标溶液150 μl。分别进行室温( 25℃) 保存4h、在4℃冰箱保存24 h、在- 20℃进行三次冻融循环、在- 20℃冻存30 天四种操作。每个操作完成低中高三个浓度的样本，平行5 份。按本文的血浆预处理方法进行处理后，进样，测定峰面积比值。
3. 6 水合橙皮内酯的药动学测定水合橙皮内酯在大鼠体内的药代动力学实验结果Wister 大鼠灌胃枳壳和水合橙皮内酯单体后，水合橙皮内酯血药浓度药- 时曲线见图3，采用DAS( 2. 0) 药动学软件对大鼠血药浓度- 时间数据进行处理，结果符合一级吸收二房室模型。用此模型拟和药- 时曲线，求算其药动学参数值，其中Cmax，Tmax 按实测值计算，AUC 按梯形法计算，结果见表4。P < 0. 01 表示两组药动学参数差异有显著的统计学意义。
4 讨论
本实验建立了新的血浆中水合橙皮内酯的RP - HPLC 测定方法，由图2 所示，空白血浆加对照品血浆样品色谱图，分离效率好，专属性强，血浆中杂质或内源性物质均不干扰测定，方法简单，保留时间短，灵敏，所用化学试剂少，毒性低，并且减少实验费用。结果显示，枳壳和水合橙皮内酯单体在同一给药途径下，房室模型虽然相同，但是水合橙皮内酯在两种给药情况下药动学参数t1 /2，Cmax 和AUC0 - 24有明显差别( P < 0. 01) ，水合橙皮内酯在枳壳组中比水合橙皮内酯单体组给药的达峰时间长，消除速率慢，血浓度低，生物利用度低，可能是由于枳壳中的其他成分减少了水合橙皮内酯吸收而降低生物利用度。而其具体抑制药物吸收的机制有待进一步研究。
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